可靠的長時(shí)間活細(xì)胞成像

本文主要討論如何使用專門配置的徠卡倒置顯微鏡和臺(tái)式細(xì)胞培養(yǎng)箱輕松、可靠地研究多孔板中培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞（SMC）的劃痕愈合情況。血管受損后影響SMC增殖和遷移的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)情況在醫(yī)學(xué)研究中有重要意義。由于SMC遍布全身，所以對(duì)其遷移情況的研究也有助于癌癥和損傷的治療。

引言

研究人員主要研究血管損傷后及動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展過程中控制SMC的增殖和遷移的機(jī)制和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)情況[1,2]。這些平滑肌細(xì)胞和脈管系統(tǒng)遍及全身各部位的每一種組織內(nèi)，包括但不限于肺部、腸道和大腦。已發(fā)表的研究報(bào)告已經(jīng)證實(shí)了SMC的增殖和遷移在癌癥、眼部損傷以及動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展過程相關(guān)[1,2]。本文主要講述如何通過徠卡倒置顯微鏡和臺(tái)式細(xì)胞培養(yǎng)箱以更加有效、可靠的方式研究多孔板中培養(yǎng)的SMC相關(guān)的劃痕愈合情況。

挑戰(zhàn)

在融合的單層細(xì)胞形成劃痕時(shí)，須隨時(shí)監(jiān)測劃痕的再生和“愈合"情況，以測定其恢復(fù)能力[3]。這就需要一個(gè)可靠的成像解決方案，該解決方案應(yīng)能：1）讓細(xì)胞存活更長時(shí)間，及2）即使在多孔板內(nèi)成像，也可在成像過程中持續(xù)將焦點(diǎn)放在細(xì)胞上。

方法

在此研究中，多孔板內(nèi)貼壁培養(yǎng)的融合單層SMC生成“劃痕"。其是由p200移液器吸頭造成的。為研究劃痕愈合情況，緊接著使用物鏡為10x/0.32 NA（數(shù)值孔徑）的DMi8 倒置顯微鏡在相差模式下觀察細(xì)胞生長情況19個(gè)小時(shí)以上。使用了量子載物臺(tái)和臺(tái)式培養(yǎng)箱來培養(yǎng)細(xì)胞[4]。載物定位的可再現(xiàn)性功能確保在拍攝多個(gè)位置后不會(huì)丟失觀察位置。自適應(yīng)焦點(diǎn)控制（AFC）可使物鏡“鎖定"樣本從而保持焦點(diǎn)，因?yàn)锳FC會(huì)主動(dòng)檢查樣本和物鏡的距離，隨時(shí)且隨板孔的變化保持焦點(diǎn)。每20分鐘拍攝一次圖像，共有114個(gè)時(shí)間點(diǎn)。整個(gè)過程對(duì)3個(gè)孔中的劃痕區(qū)域進(jìn)行了觀察。采集圖像后，使用Leica 2D分析軟件對(duì)其進(jìn)行處理，計(jì)算隨著時(shí)間推移劃痕面積發(fā)生的變化。整個(gè)實(shí)驗(yàn)包括對(duì)照共檢測了4個(gè)不同孔。

結(jié)果

圖1中，單個(gè)位置顯示為19小時(shí)采集的代表性時(shí)間序列，并顯示了典型的劃痕愈合進(jìn)展情況。面積隨時(shí)間的變化分析結(jié)果如圖1的下半部分所示。圖2所示為繪制的4個(gè)孔中3個(gè)孔隨時(shí)間變化的曲線，說明劃痕愈合的進(jìn)展情況，即單層細(xì)胞在劃痕中的再生。

圖1：劃痕愈合過程中的SMC圖像。A-E所示為位置1在A) 0小時(shí)、B) 4小時(shí)40分、C) 9小時(shí)20分、D) 14小時(shí)、E) 18小時(shí)40分時(shí)未處理圖像裁剪部分。A’-E’所示為計(jì)算劃痕愈合率時(shí)處理的相應(yīng)面積，其中黃線表示細(xì)胞與開放空間之間的邊界。比例尺為200 um。圖片由弗吉尼亞大學(xué)資深科學(xué)家Laura S. Shankman博士提供。

圖2：劃痕面積隨時(shí)間變化的曲線說明單層細(xì)胞隨著時(shí)間的推移的恢復(fù)情況。在3個(gè)單獨(dú)的孔中監(jiān)測劃痕恢復(fù)情況，并將此標(biāo)記為位置1至3B。位置3A和3B處于同一孔中，但是同一劃痕的不同區(qū)域。

結(jié)論

本研究的結(jié)果表明，使用專門配有量子載物臺(tái)、自適應(yīng)焦點(diǎn)控制（AFC）和臺(tái)式培養(yǎng)箱的DMi8 倒置顯微鏡，可輕松對(duì)多孔板中培養(yǎng)的SMC的劃痕愈合的過程進(jìn)行研究。

參考文獻(xiàn)

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2. O. Cherepanova, D. Gomez, L. Shankman, P. Swiatlowska, J. Williams, O.F. Sarmento, G.F. Alencar, D.L. Hess, M.H. Bevard, E.S. Greene, M. Murgai, S.D. Turner, Y.-J. Geng, S. Bekiranov, J.J. Connelly, A. Tomilin, G.K. Owens, Activation of the pluripotency factor OCT4 in smooth muscle cells is atheroprotective, Nat. Med. (2016) vol. 22, pp. 657–665, DOI: 10.1038/nm.4109.

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